דיון קצר על הסינתזה הכימית של תרופות אוליגונוקלאוטידים וריאגנטים לזרחן-CTPPA

(ריאגנטים של זרחן-CTPPA:2-ציאנואתיל N,N,N',N'-tetraisopropylphosphorodiaMidite CAS No.:102691-36-1)

תחום תרופות חומצות הגרעין משך תשומת לב רבה בשנים האחרונות. האישור וההשקה של תרופות חומצות גרעין הואצו, ומספר תרופות כאלה בעלות פוטנציאל להפוך למוצרי שובר קופות פרסמו נתונים קליניים, המכסים תחומים כמו מחלות לב וכלי דם ומטבוליות, מחלות כבד ומחלות נדירות שונות. נכון למחצית הראשונה של 2025, סה"כ 22 תרופות חומצות גרעין קטנות (כולל כאלה שכבר נסוגו מהשוק) אושרו לשיווק ברחבי העולם, המורכבות מ-13 תרופות ASO, 7 תרופות siRNA ו-2 תרופות מבוססות-ליגנד.

מבחינת סיווג, תרופות ASO מהוות את הנתח הגדול ביותר, כאשר 13 תרופות משווקות מהוות 59.09% מהכלל. לאחר מכן תרופות siRNA, כאשר 7 תרופות משווקות מהוות 31.81%. מנקודת מבט של אינדיקציות, 17 תרופות מתמקדות במחלות נדירות גנטיות, 3 מתמקדות במחלות עיניים, 1 מטפלת במחלות לב וכלי דם, ו-1 מתמקדת בסיבוכים המטולוגיים אונקולוגיים. התפלגות האינדיקציות מציגה דפוס של "מחלות נדירות כמוקד העיקרי, עם פריצות דרך על פני מספר תחומים". ניכר כי היישום הקליני של תרופות חומצות גרעין קטנות מתרחב בהדרגה אל מעבר לתחום המחלות הנדירות לאזורי מחלה אחרים.

עם המחקר ההולך וגובר על תרופות חומצות גרעין, ייצור-בקנה מידה גדול של תרופות אוליגונוקלאוטידים שונות יהפוך בהדרגה למגמה עתידית, שביניהם סינתזה כימית היא השיטה העיקרית לסינתזה של אוליגונוקלאוטידים קצרים-. לאחר שעברו יותר מחצי מאה של פיתוח, שיטות הסינתזה הכימית של אוליגונוקלאוטידים התפתחו משיטת הפוספודיסטר הראשונית, לשיטת הפוספוטריסטר ושיטת הפוספיט, ולאחר מכן לשיטת הפוספורמידיט הבשלה כיום. בדומה לסינתזת פפטידים, ניתן לחלק את סינתזת האוליגונוקלאוטידים לסינתזת-תמיסה וסינתזת-פאזה מוצקה מנקודת מבט אחרת. מאמר זה מציג את "ריאגנטים זרחן" הנפוצים ביותר ואת היישומים שלהם בסינתזה של מונומר נוקלאוזידים.

איור 1 ריאגנטים פוספיטליציית וריאגנטים הפעלה

בסינתזה של אוליגונוקלאוטידים, הכנת מונומרים נוקלאוזידים היא שלב הכרחי. נכון לעכשיו, ישנם שני ריאגנטים פוספיטילציה עיקריים בשימוש נרחב לסינתזה של מונומרים נוקלאוזידים שונים: האחד הוא 2-cyanoethyl N,N-diisopropylchlorophosphoramidite (1) [1]; השני הוא bis(diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)phosphin (2) (איור 1) [2]. 2-Cyanoethyl N,N-diisopropylchlorophosphoramidite (1) מפגין את התגובתיות הגבוהה ביותר ומתעבה בקלות עם אלכוהול. לעומת זאת, ביס(דיאיזופרופילאמינו)(2-ציאנואתוקסי)פוספין (2) דורש הפעלה באתרית המזוזת על ידי ריאגנטים חומציים חלשים כגון טטרזול לפני שהוא יכול לעבור עיבוי עם אלכוהול (איור 1). מנקודת מבט מעשית, 2-cyanoethyl N,N-diisopropylchlorophosphoramidite (1) יקר יותר מ-bis(diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)phosphin (2). בשל התגובתיות הגבוהה שלו, 2-cyanoethyl N,N-diisopropylchlorophosphoramidite (1) נוטה יותר להתפרקות, מה שהופך את השימוש והאחסון שלו לבלתי נוחים. הוא גם נוטה להחדיר זיהומים נוספים במהלך התגובה, וכתוצאה מכך טוהר ותפוקה פחות אידיאליים. לכן, bis(diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)phosphine (2) הוא כיום המגיב הנפוץ יותר לפוספיטילציה בהכנת מונומרים נוקלאוזידים, ולעתים קרובות הוא מקוצר כ"ריאגנט זרחן".

איור 2 מנגנון התגובה של טטרזול-פוספיטילציה מזורזת

בתהליך העיבוי בין "ריאגנטים זרחן" לאלכוהול, בדרך כלל מוסיפים כמות סטוכיומטרית או תת--סטוכיומטרית של מגיב מפעיל. ריאגנטים המפעילים הנפוצים ביותר כוללים טטרזול, 4,5-dicyanoimidazole ו-pyridinium trifluoroacetate [3,4]. נכון לעכשיו, מנגנון תגובת העיבוי בין "ריאגנטים זרחן" לבין אלכוהול המזרזים על ידי טטרזול נחקר ביסודיות [5-7].

התגובה מתנהלת באופן הבא: ראשית, "ריאגנט הזרחן" עובר פרוטונציה; לאחר מכן, diisopropylamine מוחלף על ידי tetrazole; לאחר מכן, טטרזול מוחלף באלכוהול (איור 2). בין השלבים הללו, ההחלפה של דיאיזופרופילמין בטטרזול היא השלב הקובע את הקצב.

מבין שלושת הריאגנטים המפעילים שהוזכרו לעיל, לטטרזול יש את החומציות החזקה ביותר (pKa=4.89) [3], אשר דומה לזו של חומצה אצטית (pKa=4.74). לעומת זאת, 4,5-dicyanoimidazole (pKa=5.20) [3] ו-pyridinium trifluoroacetate (pKa=5.23) ​​[3] מציגים חומציות חלשה יותר.

מכיוון שקבוצת ההידרוקסיל 5'- במונומרים נוקלאוזידים מוגנת בדרך כלל על ידי קבוצת החומצה-לאבילית 4,4'-dimethoxytrityl (DMT), השימוש ב- tetrazole עשוי להיות מלווה בתגובת לוואי של הסרת ההגנה מה-DMT. לכן, 4,5-dicyanoimidazole (pKa=5.20) ו-pyridinium trifluoroacetate (pKa=5.23) הם לפעמים בחירות אידיאליות יותר.

בנוסף, קוך וחב'. דיווח שכאשר נעשה שימוש ב-4,5-dicyanoimidazole כמגיב המפעיל, ניתן להשיג המרה מלאה עם רק 0.7 שווי ערך של המגיב. לעומת זאת, שימוש ביותר משווי ערך אחד נוטה להיווצרות תוצרי לוואי של דימרים [4].

מאפיינים של "ראגנט זרחן-CTPPA"

"ריאגנט זרחן" הוא נוזל חסר צבע או צהוב חיוור עם נקודת רתיחה גבוהה יחסית (115 מעלות /0.6 טור). הוא רגיש הן לחמצן והן ללחות ונוטה להתפרק בקלות במהלך זיקוק ואקום, מה שהופך את הייצור בקנה מידה גדול של מוצר זה למאתגר. בינתיים, בשל תכונותיו המיוחדות, גם בדיקת איכות של מגיב זרחן מעוררת קשיים משמעותיים. למשתמשים, לאחר כל שימוש, יש להגן על המגיב בחנקן ולאחסן במכונת ייבוש. תרגול זה יכול להאריך את חיי השירות של המגיב.

חברתנו עוסקת במחקר ופיתוח ובייצור של ריאגנט זרחן כבר קרוב לעשור, וצברה ניסיון רב בייצור ובדיקת המוצר. נכון לעכשיו, אנו יכולים לספק "ריאגנט זרחן" ברמת טוהר- גבוהה בקנה מידה של קילוגרם. בנוסף, אנו מספקים גם מוצרים נלווים כגון טטרזול ו-4,5-dicyanoimidazole. אנו מקדמים בברכה חברים עם צרכים רלוונטיים לפנות אלינו (טבלה 1).

טבלה 1 מוצרים רלוונטיים המיוצרים ונמכרים על ידי החברה שלנו

הפניות

[1] סינהא, נ"ד; מקמנוס, ג'יי; Köster, H. Nucleic Acids Research 1984, 12, 4539.

[2] נילסן, ג'; טאגארד, מ.; Marugg, JE, et al. מחקר חומצות גרעין 1986, 14, 7391.

[3] סנגבי, י"ש; גואו, ז; Pfundheller, HM, et al. פיתוח מחקר תהליכים אורגני 2000, 4, 175.

[4] Pedersen DS; רוזנבוהם סי; Koch T. Synthesis 2002, 802.

[5] נורמינן, ע"ג; Mattinen, JK; Lönnberg, H. Journal of Chemical Society, Perkin Transactions 2, 1998, 162.

[6] ברנר, ש; Mühlegger, K.; Seliger, H. Nucleic Acids Research 1989, 17, 853.

[7] דאל, ב"מ; נילסן, ג'; Dahl, O. Nucleic Acids Research 1987, 15, 1729.